背景
外周动脉疾病，动脉的堵塞可引发一系列代偿性事件如粥样硬化，血管新生以及随后的缺血组织的再灌注。治疗策略之一就是通过给予生长因子及血管生成细胞来促进血管新生。虽然在一些急性动脉结扎的动物模型中已经有血管新生治疗成功的报道，但对于疾病组如糖尿病个体，这样的治疗还没有展现出确定性的可靠证据；
内皮糖萼层是衬于内皮细胞表面的一层带负电荷胶冻样的结构，在维持血管壁完整及稳态方面如血管通透性、机械力传导、炎症及凝血过程中皆起到关键性作用。其中，在维持血管稳态方面，生长因子及细胞因子选择性结合于内皮糖萼是其最基本的步骤。在病理状态如炎症、高血糖及粥样硬化发生时，内皮糖萼可被类肝素酶或透明质酸酶所降解，受损的糖萼层可引起内皮功能障碍，继而导致微循环灌注效能减低甚至损伤；
透明质酸是内皮糖萼层的主要结构成分之一，由细胞浆膜面的内侧面的合成酶如HAS1、HAS2或HAS3等合成后再分泌到细胞外。HAS2缺乏的小鼠因心血管发育的重大缺陷，在妊娠早期即发生死亡，提示透明质酸（HA）可能是血管信号传导的重要分子；
在1型及2型糖尿病患者中，皆观察到内皮HA的剥脱，此现象被认为是糖尿病血管及肾脏并发症的致病性因素；
在股动脉闭塞的动物模型中，以HAS抑制剂（4-甲基七叶苷）去除内皮的HA，可极大程度使侧枝动脉的重构受损。这是由于机械传导出现紊乱导致平滑肌细胞的激活（血管重构必须的步骤）受抑制所致；
最近已有回顾性文章阐述HA在糖尿病微血管并发症中的关键性作用，然而其在微循环灌注以及血管新生的过程中所起的作用知之甚少；
本篇研究中，作者期望通过对腓肠肌内股动脉结扎作为模型，研究内皮透明质酸（HA）在修复微循环灌注中的作用,以探寻其促血管新生的潜在价值。进一步发掘以内皮HA丢失作为治疗靶点的潜在获益。
研究方法
动物模型的建立：所有实验组小鼠皆经内皮特异性HAS2基因敲除（Has2-cKO），同对照组小鼠做比较。开始饲养动物时，皆从其耳部取样并检测DNA。实验结束后通过PCR及基因启动子检测，以确定经他莫昔芬作用于Has2-cKO小鼠所导致的has2基因的突变。只有那些经Has2基因敲除（Has2-cKO）的小鼠并且后续确定其has2基因突变的小鼠，才会进一步予以检测。将8周大的小鼠（Has2-cKO）同对照组小鼠连续5天在腹膜腔内注射2mg/0.2ml的他莫昔芬，最终经他莫昔芬注射的小鼠有80%的比例可具有足量基因再剪辑后的腓肠肌组织。他莫昔芬组处理4周后，对两组小鼠行单侧或双侧股动脉结扎手术，此后进行连续14天的激光多普勒灌注显像（LDPI）及体重测量。在动脉结扎前1天及14天后（处死）抽血：在异氟烷麻醉下，经心脏穿刺处死小鼠，提取血液并灌注固定。内收肌及腓肠肌组织皆予收集并以石蜡包埋。
人体组织标本：提取2型糖尿病伴严重肢体缺血的患者的组织标本，入选标准：≥18岁并行下肢截肢，除外踝、足或足趾等截肢部位。排除标准：可疑或明确恶性肿瘤患者或者无法签署知情同意书。在截肢后马上提取组织标本，迅速冷冻并储存于-80℃条件下。
其他实验室方法包括：组织学、免疫组化、病毒转染、血管新生检测、内皮细胞/周细胞共培养法、实时PCR检测法以及免疫印迹法。
统计方法：数值以平均值±标准差表示，所有试验皆经3-5次重复检测，所有数据皆经过Shapiro-Wilk检测以及Levene’s检测以评估正态分布及差异性。对于正态分布及差异性均等的数据，两组的差异以双尾t检测评估。多组数据以单向ANOVA及Tukey检验评估。如果数据不符合正态分布或者差异不均等，采用Mann-WhitneyU检验。P值＜0.05被认为具有统计学显著差异。
研究结果
内皮HA的慢性丢失导致后肢灌注减少（见图1）；
内皮HA的丢失导致肌肉损伤以及股动脉结扎后过度的血管新生（见图2）；
内皮HA的丢失可降低内皮血管生成素1的表达（见图3）；
在体外，内皮HA的丢失可增强内皮新生，并增加内皮不稳定性（见图4）；
糖尿病的缺血的肌肉组织中，内皮HA的表达减低（见图5）；
图1.内皮细胞HA的丢失可导致后肢灌注减少
A：动脉影像；
B：腓肠肌的小血管，分别显示Has2-cKO小鼠及对照组小鼠。以HA结合性探针Ncan-dsRed进行荧光染色，以凝集素（绿色）进行内皮定位，α-SMA反映平滑肌细胞；
C：内皮细胞内凝集素定位后对HA进行量化强度分析；
D和E：采用激光多普勒灌注显影，显示结扎前HAS2-cKO小鼠的后肢呈显著低灌注状态；*P＜0.05，**P＜0.01.
图2.内皮HA的丢失导致肌肉损伤以及股动脉结扎后过度的血管新生
A：HE染色显像；
B：Has2-cKO小鼠及对照组小鼠的内收肌在经动脉结扎或非结扎后，肌肉细胞区域进行定量分析；
C：Has2-cKO小鼠经单侧股动脉结扎后，HE染色显示血管稀少；
D：凝集素定位内皮细胞（绿色），以HA结合探针Ncan-dsRed对HA染色；HA染色可用作观察肌纤维母细胞，以图中白色箭头表示，肌纤维母细胞外周围绕着的就是HA；
E：Has2-cKO小鼠及对照组小鼠的腓肠肌经动脉结扎或未结扎后，血管灌注功能的量化分析（数值皆经标准化处理，即以两组小鼠皆经痊愈后的指标作为参考值做标准化处理）。
图3.内皮HA的丢失可降低内皮血管生成素1的表达
A：血管生成素1、凝集素染色以定位EC的染色显影；
B：经结扎或非结扎后内皮相关血管生成素1的量化分析；
C：经结扎或非结扎后血小板剥夺抑制因子受体β（PDGFRβ绿色）、层粘连蛋白（红色）以及共染色（黄色）的重叠影像；
D：血管内皮生长因子（VEGF绿色）、凝集素（红色）的重叠影像；
E：Has2-cKO小鼠及对照组小鼠的腓肠肌经动脉结扎或未结扎后，VEGF及内皮区域比例的量化分析。*P＜0.05
图4.在体外，内皮HA的丢失可增强内皮新生，并增加内皮不稳定性
为在体外检测HA的功能，应用短链发卡RNA来沉默内皮细胞中HAS2的表达。
A：以CD31（绿色）和α-SMA（红色）染色并显示内皮细胞-周细胞共培养的血管新生检测；
B：HAS2基因被沉默后血管区定量分析显示血管新生增加；
C：HAS2基因被沉默后血管分支区域定量分析显示血管新生增加；
D：内皮细胞-周细胞共培养显影；
E：.以VE-Cadherin/CD（绿色）和F-actin（红色）染色后侧面观，内皮细胞位于周细胞上方；
F：线性粘附性间隙的定量分析提示，HAS2基因沉默后内皮不稳定性增加；
G+H：影像学显示或应用WesternBlot定量测定p-Tie2，Tie2以及GAPHA，提示Has2基因被沉默后，同对照组比较，Tie2激活程度减低；
I：Has2基因被沉默后，ICAMmRNA表达增加，提示HA丢失后内皮细胞激活程度增强。
*P＜0.05
图5.糖尿病的缺血的肌肉组织中，内皮HA的表达减低
A：动脉显影；
B：2型糖尿病伴严重下肢缺血患者缺血肌肉中的小血管，以HA结合探针Ncan-dsRed（红色）及CD31（绿色）染色以定位内皮细胞；
C：以CD31共定位内皮细胞后定量分析内皮细胞中含有HA的强弱
D：HE染色（上排）和HA染色（下排）分别显示2型糖尿病足患者的正常肌肉组织和缺血肌肉组织
*P＜0.05
结论
内皮透明质酸（HA）在维持血管稳定性方面起着重要作用。
在糖尿病缺血的肢体中，血管的稳定性受损，内皮HA合成及降解平衡的维持可作为启动Ang1/TIE2信号通路的修复靶点，以撬动微血管对缺血的适应性改变，这种适应性改变包括抑制透明质酸酶或通过对糖合成的调节来增强内皮HA的合成
文献解析
此研究显示内皮HA在缺血性结局中微血管灌注及血管新生反应中的关键作用，例如在2型糖尿病中所见。在细胞水平，内皮HA的丢失可降低Ang1/TIE2信号传导的效力，导致血管不稳定性并抑制微血管的完整再灌注过程。本研究中，非糖尿病Has2-cKO小鼠模型，股动脉结扎后内皮HA降低导致肌肉损伤，肌肉损伤部位呈现脂肪细胞浸润、水肿，且毛细血管不稳定性增加，这种变化同2型糖尿病患者缺血肢体的组织标本中所呈现的病理性改变类似。
透明质酸（HA）在血管完整性维持方面起到关键作用。以透明质酸酶降解透明质酸后可导致大鼠的灌注心肌出现心肌水肿。内皮糖萼包括HA的降解同内皮功能障碍及血管损伤所致的微循环灌注减低相关。高分子量HA可增强人肺内皮细胞屏障功能并可抑制脂多糖诱导的肺毛细血管渗漏。作者既往的研究中曾展示过小鼠内皮特异性的Has2基因敲除可导致HA无法嵌入内皮糖萼层，引起内皮功能障碍及多种组织如肾脏、视网膜及心脏的内皮不稳定性。此项研究作者进一步探究内皮HA丢失后毛细血管灌注受损，同时对动脉结扎血管新生的反应减弱，此项研究同临床实践中糖尿病患者的严重肢体缺血有很强的关联性。
此研究中显示，内皮特异性HA移除可诱导动脉结扎的内收肌内血管渗漏及组织水肿，提示血管重构过程中血管成熟及稳定性效能减低。此外，这同缺血的适应性血管新生及微循环受损亦相关。从这个角度出发，增加HA可在后肢缺血模型中增强内皮新生血管的细胞治疗的疗效。此外，通过剪切力调节的转录因子KLF2，可直接增加HAS2蛋白表达，并将酶转位至细胞膜，在细胞膜上通过PFKFB3酶调控内皮糖化合成的速度，而PFKFB3酶可限制HA的底物UDP-葡糖胺以及UDP-葡醛酸，从而进一步调节HA的生物合成。因此，组织灌注的损伤可进一步加重上述过程，也就降低了HA的生物合成。
此研究所观察的现象，同糖尿病患者极其相关。在研究中观察了在严重肢体缺血中微血管的HA的丢失，糖尿病是粥样硬化病变的主要危险因素，严重肢体缺血是糖尿病非创伤性截肢的最常见病因。在糖尿病中，血管新生疗法如生长因子的基因治疗以及骨髓移植皆无法获得确定性的治疗进展。
此项研究为进一步探索HA的丢失如何导致血管不稳定性奠定了基础。血管新生是在既有血管存在的基础上血管生长的过程。血管生成素（Ang）/TIE2信号通路被认为是控制血管新生“发芽”、血管重构以及在沉默-活化内皮细胞之间进行细胞迁移的关键因素。通过Ang2作用于VEGF或者缺氧而导致的Ang1/TIE2信号的减低可导致周细胞同内皮细胞及发芽处的顶部细胞脱离。Ang1/TIE2信号通路在血管稳定性及完整性方面也起到非常重要的作用。周细胞不仅分泌生长因子如PDGF、VEGF以及Ang1以增强内皮细胞的存活力，还可通过Ang1/TIE2信号通路保持血管的稳定性。伴随缺血后的血管新生过程，初始TIE2信号途径的减弱决定了早期血管不稳定性，随后的Ang1的减低对于之后的血管成熟及功能性血管新生起到关键作用。
参考文献
WangG,deVriesMR,SolWMPJ,etal.LossofEndothelialGlycocalyxHyaluronanImpairsEndothelialStabilityandAdaptiveVascularRemodelingafterArterialIschemia.Cells.,29;9(4):1-13
舒洛地特改善下肢外周动脉疾病患者的无痛行走距离：一项系统性回顾和meta分析
天然成分治疗慢性静脉疾病的疗效更佳且更安全——舒洛地特治疗对慢性下肢静脉疾病症状和体征治疗的系统性回顾及Meta分析
历久弥新：舒洛地特治疗慢性静脉疾病作用机制的新认知
舒洛地特治疗慢性静脉功能不全——全俄罗斯多中心ACVEDUCT项目研究结果揭示
舒洛地特通过内皮依赖性一氧化氮介导的途径促进动脉舒张——舒洛地特作用于动脉舒张机制的最新研究
舒洛地特可促进呈持续拉伸状态的静脉的收缩能力并降低MMP2/MMP9的表达——舒洛地特作用于静脉收缩机制的最新研究
血管资讯VascularNews
专注血管外科领域宣传与继续教育新媒体
合作联系
VascularNews
.
