作者：何欢刘祖国林志荣刘晓琛何卉肖启国
目的探讨普拉洛芬对苯扎氯铵诱导小鼠干眼的治疗作用及其可能机制。方法实验研究。选用BALB/c雄性小鼠70只，使用0．25%的苯扎氯铵溶液局部点眼以诱导干眼。在第21天时根据泪膜破裂时问(BUT)、角膜荧光素钠染色、炎症指数等参数选择干眼表现程度相似的眼并随机分为A、B、C、D四组。A组为空白对照，B、C、D组分别使用0．1%玻璃酸钠滴眼液，0．1%玻璃酸钠滴眼液加0．1%氟米龙滴眼液，0.1%玻璃酸钠滴眼液加0．1%普拉洛芬滴眼液进行治疗。治疗后第0、1、3、5天进行BUT检测、角膜上皮荧光素钠染色，眼表炎症程度的评估及基础泪液量的测量。治疗结束后取下小鼠眼球，进行HE及过碘酸一希夫(PAS)染色，角蛋白10(K10)免疫荧光标记，以及Westernblot检测角结膜组织中肿瘤坏死因子仅α(TNF-α)表达水平。对方差齐性的数据采用Tukey显著性检验，对方差非齐性的数据采用Dunnett检验。
结果经筛选共36只鼠(72只眼)入选治疗实验，每组18只眼。在使用药物治疗后的第0、1、3天各项临床指标差异无统计学意义。治疗第5天时，A、B、C、D组泪BUT分别为(2．±0．)、(2．±0．)、(3．±0．)和(3．-0．)S；其中C组与D组的BUT均较A组和B组延长，差异具有统计学意义(F=13．，P=0．)。角膜荧光素钠染色分级A、B、C、D组分别为(11．-1．)、(11．±1．)、(10．-1．)及(10．±1．)分；两联合用药治疗组均较人工泪液组和空白对照组角膜荧光素钠染色分级减轻，具有统计学意义(F=6.，P=0.)。角膜炎症指数评分A、B、C、D组分别为(0.±0.)、(0.-0．)、(0.±0．)及(0.-0.)分；两联合用药治疗组均较人工泪液组和空白对照组炎症指数降低，差异具有统计学意义(F=6．，P=0．)。各组间的基础泪液分泌量差异无统计学意义。HE结果显示空白对照组上皮厚度高于两联合用药组，联合用药组上皮规整；PAS染色示普拉洛芬组及氟米龙组的杯状细胞数量相当，均多于人工泪液组及空白对照组。普拉洛芬组及氟米龙组的角膜上皮层均几乎不表达K10，而人工泪液组及空白对照组仍阳性表达。普拉洛芬组及氟米龙处理组角膜中的TNF一仅水平均有下降。结论普拉洛芬具有抑制苯扎氯铵溶液局部点眼诱导干眼眼表炎症的作用，有望用于干眼眼表炎症的临床治疗。(中华眼科杂志，，48：33-40)
干眼病；消炎药，非甾类；丙酸类；苯吡喃类；小鼠；肿瘤坏死因子a
干眼是常见的眼表疾病，国外发病率约10%～33％[1-2]，亚洲及我国的发病率可能更高。目前环境污染、生活习惯改变、眼部用药增加都使干眼的发病率逐渐增高。干眼是一种泪膜和眼表的多因素疾病，能引起眼部不适感、视觉障碍、损坏眼表组织，引起泪膜不稳定，并伴有泪液渗透压的升高和炎症反应[3]。既往研究明确了炎症在干眼的发生发展中起着关键的作用。炎症作为病因，可以触发眼表炎症及免疫的循环反应；炎症可以推动干眼的病程进展，破坏眼表及泪腺组织的结构与功能，破坏泪膜的稳定性，引起恶性循环；炎症作为结果，使眼部出现红、痒、干涩甚至导致视力波动。因而抑制炎症是干眼治疗十分重要的措施。目前用于干眼治疗的药物包括糖皮质激素、环孢霉素A、四环素等，但是它们都存在一定不足，如糖皮质激素长期使用可引起高眼压、黄斑囊样水肿，环孢霉素A可致局部免疫低下，四环素类全身副作用大等。非甾体类药物普拉洛芬用于治疗眼前节炎症已有数年，疗效较佳且副作用少，但在干眼中是否具有治疗效果尚缺乏研究[3-4]。本研究通过建立苯扎氯胺诱导的小鼠干眼模型[6-7]，采用随机对照单盲动物实验的方法，探讨普拉洛芬滴眼液对小鼠干眼的治疗效果，为其临床应用提供一定依据。
材料和方法一、小鼠干眼模型诱导
健康雄性BALB/c小鼠70只(共只眼)，体重(20±2)g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。使用苯扎氯铵溶液滴眼(0．25，每次5μl，2{12,/d)诱导出具有干眼表现的小鼠[7]。小鼠饲养于以下标准环境中：温度(-1)℃，相对湿度(60±10)。第2天时对小鼠进行干眼临床评估，包括酚红棉丝实验、泪膜破裂时间(breakuptime，BUT)、荧光素钠染色及角膜炎症指数(方法见后)，将70只小鼠的各项临床指标进行统计学分析，算成各项临床指标的均值，选出各项临床指标在均数±标准差范围内最接近指标均值的小鼠纳人后续治疗实验。
二、实验方法
将入选的小鼠随机分为A、B、c、D四组，A组为空白对照，B、c、D组分别应用0.1%玻璃酸钠(日本参天制药)，0.1%玻璃酸钠+0.1％氟米龙(日本参天制药)，0.1%玻璃酸钠+0.1%普拉洛芬(日本千寿制药)治疗，3/d，每次μl。两药联用时，用药间隔为30min。在治疗后的第0、1、3、5天分别进行SehirmerI泪液分泌量检测、BVT、荧光素钠染色及角膜炎症指数评分。临床评估均采用单盲原则。治疗结束后，将眼部组织取下，进行相应组织学染色及Westernblot蛋白检测。
1．泪液分泌量检测：在每个时间点的同一时段(3PM)使用ZONE-QUICK?酚红棉丝(日本Yokota公司)进行SehirmerI泪液分泌量测试。小鼠腹腔注射戊巴比妥(50mg/kg体重)全身麻醉后，拉开下睑，将酚红棉线折端长1mm的部分，放置在下睑接近外眦部的睑结膜面15s，测量并记录棉线变红部分长度。测试完成后，闭合睑裂避免过度暴露。
2．BUT：将1μl的1％的液态荧光素钠滴至结膜囊并闭合后，裂隙灯显微镜(重庆康华公司)钴蓝光下观察。3次瞬目后，以最后1次瞬目至角膜出现第1个黑斑的时间为BUT。
3．角膜荧光素钠染色评分：在滴人荧光素钠后90S时，在裂隙灯显微镜钴蓝光下进行角膜上皮荧光素钠染色分级。角膜平均分成4个象限并分别评分，将所有分值相加得到最后分值。评分标准M1：无染色：0分；点状着色少于30个：1分；多于30个的点状着色但不弥散：2分；严重的弥散染色但无斑块状染色：3分；有斑块状染色：4分。
4.角膜炎症指数：使用裂隙光带进行角膜炎症指数评估。炎症指数由3部分组成[8]：睫状充血(无充血：0分；有充血带但宽度小于1mm：1分；充血带宽度大于2mm：3分)；中央角膜水肿(无水肿：0分；轻度水肿，虹膜纹理仍清晰：1分；中度水肿，虹膜纹理不清：2分；虹膜及瞳孔不可见：3分)；周边角膜水肿(评分标准同中央角膜水肿)。最终的角膜炎症指数为3部分评分总和除以9。
5．组织染色：组织取下后，4%多聚甲醛固定后分别进行石蜡及OCT包埋。小鼠眼部组织(含完整上下眼睑及睑球结膜)的石蜡切片行PAS染色，以胞质染色深红者为结膜杯状细胞，每眼取6张不同等分位置的切片分别计数，取其平均值为该眼的杯状细胞数量。OCT包埋标本行冰冻切片的HE及间接免疫荧光染色，一抗为K10抗体(1：，美国abcam公司)，荧光二抗为AlexaFluor(1：1，美国Invitrogen公司)，使用DAPI(美国Vector公司)复染荧光标本中的细胞核，在激光共焦显微镜中观察并拍照(Fluoview1，日本Olympus公司)。
6．Westernblot：分别在各组随机选取6只眼，取下相应角膜、结膜组织，置于无RNA酶Eppendorf管内，-80℃深低温冰箱保存。以变性Westernblot方法分别检测分析标本中角膜及结膜组织中TNF一仅蛋白的含量，内参为β-actin。TNF-α仅抗体(1：，美国Abcam公司)，β-actin抗体(1：10，美国Invitrogen公司)。BIO-RAD凝胶成像系统(美国Bio—Rad公司)显色，用凝胶分析软件QuantityOne(V4．3．0．)对条带密度及面积等参数进行定量分析。
三、统计学分析方法
使用SPSS13．0统计软件包进行数据分析。描述性统计值用平均值+标准差表示。对干眼临床指标及TNF．仪表达水平的相关结果，在满足方差齐性时，采用Tukey显著性检验进行多重比较；方差非齐时，则采用Dunnett检验。以P0．05作为差异有统计学意义。
结果一、小鼠干眼模型诱导结果
经对70只小鼠各项临床指标进行统计学分析，我们将各项临床指标在均数±标准差范围内最接近指标均值的小鼠共36只(72只眼)入选治疗实验，并随机分人A、B、C、D四组，每组18只眼。统计学分析显示，A、B、C、D组在治疗开始前的BUT，角膜上皮荧光素钠染色评分、泪液分泌量和眼表炎症评分的差异均无统计学意义(P值均大于0．05)(表1)。
二、临床指标的变化
1．泪膜稳定性的变化：用药后第0、1、3天，A、B、C、D四组的BUT差异均无统计学意义。用药第5天，方差分析示各组间差异有统计学意义(F=13．77，P=0．)。其中A组与B组之间差异无统计学意义(P=0．)。A组与C组及D组之间差异有统计学意义(P=0．及P=0．)，B组也与C组及D组之间差异具有统计学意义(P=0．，P=0．)，C组与D组之间差异无统计学意义(P=0．)。上述结果提示联合使用抗炎药物时，BUT较单用玻璃酸钠或不用药物治疗时明显延长，且普拉洛芬的此种作用与氟米龙相当(图1，表1)。
2．角膜上皮荧光素钠染色情况：用药后第0、1、3天，A、B、C、D四组的角膜上皮荧光素钠染色评分差异均无统计学意义。用药第5天，方差分析示各组间差异有统计学意义(F=6．15，P=0．)。其中A组与B组之间差异无统计学意义(P=0．)。A组与C组及D组之间差异有统计学意义(P=0．．0．)，B组与C组及D组之间差异具有统计学意义(P=0．，0．)，C组与D组之间差异无统计学意义(P=0．)。上述结果提示联合使用抗炎药物时，角膜上皮荧光素着染情况较单用玻璃酸钠或不用药物治疗时减轻(图2，表1)，且普拉洛芬的此种作用与氟米龙相当。角膜荧光素染色的代表性图片见图3。
3．角膜炎症指数情况：用药后第0、1、3天，A、B、c、D四组的角膜上皮荧光素钠染色评分均无统计学差异。用药第5天，方差分析示各组间差异有统计学意义(F=6．，P=0．)。其中A组与B组之间差异无统计学意义(P=1．)。A组与c组及D组之间差异有统计学意义(P=0．，P=0．)，B组与c组及D组之间差异具有统计学意义(P=0．，P=0．)，C组与D组之间差异无统计学意义(P=1．)。上述结果提示使用玻璃酸钠联合抗炎药物时，角膜炎症程度较单用玻璃酸钠或不用药物治疗时明显减轻，且普拉洛芬的此种作用与氟米龙相当(图4，表1)。
4．泪液量的改变：用药后第0、1、3、5天，A、B、C、D四组的泪液分泌量均无统计学差异(P=0．，0．，0．，0．)(图5)。5．HE染色结果分析：光镜下观察角膜、结膜及泪腺组织结构的变化。用药5d后，A组角膜上皮细胞形态不规则，愈合欠佳，细胞层数异常增多；
B组细胞层数虽接近正常水平，但上皮表面凹凸不平，c组和D组角膜上皮层的层数及形态均接近正常(图6)。提示使用玻璃酸钠联合抗炎药物治疗时，角膜上皮的修复情况较单用玻璃酸钠或不用药童物治疗时为佳，且普拉洛芬的此种作用与氟米龙篓相当。
6.结膜PAS染色结果：用药第5天时，A、B、C、D组结膜杯状细胞数量分别为（71.63±13.71）、(44．68±25．67)、(61．75±18．72)和(58．83±19．21)个。方差分析显示各组杯状细胞数量之间差异有统计学意义(F=93．85，P0．01)。其中A组与B组之间差异具有统计学意义(P=0．)，提示玻璃酸钠治疗时杯状细胞数量有所恢复。C组与B组、D组与B组之间差异均具有统计学意义(P值分别为0．及0．)，而c组与D组之间差异无统计学意义(P=0．)。提示玻璃酸钠联合抗炎药物治疗较单用玻璃酸钠能更好地恢复结膜杯状细胞数量，且普拉洛芬的此种作用与氟米龙相当(图7，8)。
7．角膜、结膜TNF-α的表达水平：治疗5d后，氟米龙组及普拉洛芬组角膜TNF—α的表达水平低于空白对照组及玻璃酸钠组，差异具有统计学意义(F=6．00，P0．01)。而各组结膜TNF-α的表达水平未见明显差异(图9～11)。
8．各组K10免疫荧光染色结果：玻璃酸钠联合氟米龙或普拉洛芬用药时，角膜上皮层KIO的表达比单用玻璃酸钠或不用玻璃酸钠时表达明显减弱(图12)。各组结膜上K10表达未见明显差异。
讨论眼表、泪腺和中枢神经形成一个功能整体，可以提供适当的反馈机制维持眼表的湿润。而干眼患者泪液渗透压的升高会激活眼表的炎症反应，炎症通过降低角膜的敏感度，抑制这种正常的反馈机制。炎症激活后，眼表上皮细胞产生大量的炎症因子和促炎因子，如TNF-α、IL一1β、MMPs等，诱导巨噬细胞、中性粒细胞浸润，激活眼表抗原提成细胞，诱导淋巴细胞浸润，进一步启动眼表炎症免疫反应，促进更多的炎症因子释放和炎症细胞的浸润，形成恶性循环[9]。炎症发展的不同阶段，对眼表功能单位都会有不同程度的损坏，主要表现为[10-11]：泪膜稳定性的降低，眼表上皮的损害，眼表上皮鳞状化生，泪腺功能障碍等。炎症因子导致的泪液高渗，炎症诱导的杯状细胞的破坏及凋亡，以及黏蛋白的减少等都会导致泪膜的不稳定。炎症因子还可以促使眼表上皮高表达角化蛋白[12]。因而炎症是干眼发病的重要环节，抑制眼表炎症是干眼治疗的关键措施之一。
苯扎氯铵滴眼诱导的小鼠干眼中，存在泪膜破坏、上皮损害、炎症因子TNF-α升高等明显的眼表炎症反应，并存在结膜杯状细胞及角膜上皮鳞化生等干眼的病理改变[13]。我们应用人工泪液联合普拉洛芬对其进行抗炎治疗，并与单用人工泪液进行对比。本研究结果显示，与未使用药物治疗及单用人工泪液治疗的组别相比，接受人工泪液联合普拉洛芬治疗的小鼠，其BUT延长、角膜上皮荧光素钠染色程度减轻、眼表炎症减轻；其角膜上皮表面平整，角膜上皮细胞层数接近正常，结膜杯状细胞数量亦接近正常小鼠，而未治疗组及单用人工泪液组的小鼠角膜上皮表面欠平整，局部角膜上皮细胞存在异常增殖或缺损，结膜杯状细胞数量也明显减少。免疫荧光染色显示，未治疗组及单用人工泪液组的小鼠角膜上皮仍高表达K1O，而普拉洛芬治疗的小鼠角膜上皮几乎不表达K1O。提示抗炎治疗可能抑制或逆转鳞状上皮化生。普拉洛芬治疗组的小鼠角膜组织TNF-α表达水平下调．证明普拉洛芬可以抑制苯扎氯铵诱导的眼表炎症反应。
普拉洛芬抑制干眼眼表炎症的机制是多方面的。炎症发生时，细胞膜及部分细胞器的磷脂层在磷脂酶A2催化下生成花生四烯酸，环氧化酶(cycloxygenase，COX)使其分解生成前列腺素E2、前列腺素D2、血栓素等，这些产物可以扩张血管、增加血管通透性，并进一步诱导炎症反应。普拉洛芬属丙酸类非甾体抗炎药，通过非选择性抑制环氧化酶，抑制花生四烯酸生成前列环素、前列腺素和血栓素等，进而改变粒细胞与T淋巴细胞反应，降低粒细胞与单核细胞的迁移与吞噬作用[14]，从而达到抑制炎症的作用。同时，非甾体类抗炎药物还可通过影响T淋巴细胞的激活，调节白细胞介素-2，干扰素-γ和TNF-α的生成[15]。我们的研究已证明普拉洛芬可以减少干眼动物模型眼表TNF—α的表达。
既往研究表明减少炎症因子TNF一α，可以抑制炎症信号通路及抗原提呈细胞的激活，减少对淋巴细胞及其他炎症细胞的诱导，并可抑制细胞凋亡，减少对杯状细胞及泪腺腺管细胞的损害，增加泪膜中的黏蛋白、表皮生长因子等，有利于泪膜功能恢复[16]。抑制TNF-α还可以减少COX-2的表达[17]，这可能是普拉洛芬抑制眼表炎症的另一机制。但更详细的机制还需要进一步研究阐明。
各类文献表示普拉洛芬同时涉及对COX-1的抑制作用，它的使用具有一定局限性。虽有报道[4-5]其他类型的非甾体类抗炎药物，在长期局部点眼后会出现角膜敏感性下降、上皮缺损及溃疡穿孔等并发症，但此类并发症发生率较低，且关于普拉洛芬的副作用不暂未存在此类报道。故使用普拉洛芬治疗干眼，较皮质类固醇激素更安全，但仍需注意其适应证及应用时间，并需密切观察。
本实验中各治疗组间泪液分泌量并无差异，可能与所用药物均无促进泪液分泌功能有关[18-19]；各组的小鼠结膜组织中TNF-d表达水平未见明显差异，推测可能是小鼠结膜所占眼表面积比例较小，苯扎氯铵诱导的眼表炎症反应主要存在于角膜的缘故。
综上所述，本研究证实了普拉洛芬具有抑制苯扎氯铵诱导小鼠干眼眼表炎症，促进泪膜恢复的作用，对治疗中重度干眼的眼表炎症有一定指导作用。
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